Izolarea virusurilor si efectele virus specifice

IZOLAREA VIRUSURILOR SI EFECTELE VIRUS SPECIFICE

Virusurile se multiplica numai pe celulele vii, care le furnizeaza materia prima, energia si chiar mecanismele de sinteza, replicarea avand loc conform informatiei genetice induse de acidul nucleic viral. Ele cultiva, in laborator, pe oua de gaina embrionate, culturi celulare sau animale de laborator.

Modificarile aparute la gazdele inoculate dau indicatii asupra grupului de virusuri caruia ii apartine virusul inoculat, identificarea speciei sau a tipului facandu-se prin reactii antigen-anticorp.

1. Oua de gaina embrionate

Cultivarea virusurilor in oul embrionat de gaina a constituit un progres remarcabil in virusologie, prin utilizarea unui sistem de celule constituit din tesuturi in dezvoltare, cu multiplicare activa, practic steril, lipsit de mijloacele de aparare antiinfectioasa existente la animalele adulte. Cultivarea se face prin inoculare in anexele embrionare: cavitatea amniotica si alantoidiana, sacul vitelin, pe membrana corioalantoidiana.

Oua de gaina embrionate, de aproximativ 6-l0 zile, sunt utilizate pentru izolarea si identificarea unor virusuri din produsele patologice sau pentru prepararea de antigene si vaccinuri virale. Inocularea in cavitatea alantoidiana si amniotica se foloseste pentru cultivarea virusurilor gripale, paragripale, v. urlian, rujeolic; pe membrana corioalantoidiana se cultiva v. herpetic si poxvirusuri.

Efecte virus-specifice pe ou embrionat: efectul hemaglutinant prin hemaglutininele virale (depozit cu marginile crenelate, franjurate in prezenta hematiilor de diverse specii); leziuni pe membrana corioalantoidiana; incluzii virale; hemoragii si moartea embrionului.

2. Culturi celulare

Sunt substrate de celule eucariote intretinute in vitro, sub forma monostratului celular. Tesuturile fragmentate in piese mici sunt disociate cu tripsina in celule individuale, diluate intr-un mediu nutritiv si introduse in recipiente de sticla sau plastic, unde se ataseaza si se multiplica pe suprafata.

Culturile de celule reprezinta astazi metoda cea mai adecvata pentru izolarea unor virusuri: enterovirusurilor, adenovirusurilor, v. paragripale, v. respirator sincitial etc. Se cunosc trei tipuri de culturi celulare (tabel 4): culturi primare (rinichi de maimuta); culturi diploide (din tesuturile embrionare), linii celulare continue (din tesuturile tumorale).

Tabel 4: Tipuri de culturi celulare

Multiplicarea virusurilor in culturile de celule se evidentiaza prin examen microscopic direct, care demonstreaza degenerarea celulelor de cultura (aparitia unor modificari morfologice ale celulelor sub actiunea virusurilor): efect citopatic (distructiv, sincitial, in focar). Astfel enterovirusurile (virusurile poliomielitice) determina aparitia unor celule mari, refringente cu desprinderea in intregime a monostratului celular in 2-3 zile; alte virusuri determina aparitia unor celule mari, multinucleate-sincitii (v. respirator sincitial, v. rujeolos, v. herpes); adenovirusurile determina o alterare localizata, cu aspect de mura - in focar.

Alte efecte virus specifice pe culturile celulare sunt: efectul hemaglutinant si efectul hemadsorbant. Unele virusuri hemaglutinante (gripal, paragripal), multiplicate in culturi de celule, isi manifesta proprietatea de a aglutina hematiile anumitor specii de animal. De asemenea, celulele in care s-a multiplicat un virus hemaglutinant sunt capabile sa adsoarba hematiile provenite de la diferite specii animale (hemadsorbtie).

Pe culturi celulare au mai fost evidentiate si alte efecte virus specifice: incluzii virale; interferenta (competitivitate); efectul transformant - modificari morfologice, genetice, metabolice.

Incluziile virale sunt formatiuni intracelulare cu o colorabilitate modificata, dezvoltate progresiv in timpul multiplicarii, reprezentand, in general, locul in care se sintetizeaza componente virale sau se asambleaza virioni. Sunt unice sau multiple, mari sau mici, rotunde sau de forma neregulata, acidofile sau bazofile, intranucleare sau intracitoplasmatice (tabel 5).

Interferenta. Unele virusuri (v. rubeolic) fara a produce efect citopatic determina un fenomen de interferenta. Cultura inoculata pentru izolarea v. rebeolic este testata catva timp mai tarziu prin infectare cu un v. citopatogen. Lipsa multiplicarii acestuia pledeaza, cu mare probabilitate, pentru prezenta in cultura a v. rubeolic.

3. Animale de laborator

Inocularea animalelor de laborator a fost prima metoda folosita pentru izolarea virusurilor si precizarea tropismului lor pentru diferite tesuturi, tropism insotit de leziuni caracteristice. Efecte virus specifice la animalele de laborator sunt: efecte clinice (v. rabic); paralizii (flasca - v. Coxsackie grup A; spastica - v. Coxsackie grup B); incluzii virale (Babes Negri - v. rabic); modificari histopatologice (v. polio - leziuni ale corpului neuronului motor periferic din coarnele anterioare ale maduvei).

Tabel 5: Exemple de virusuri ce determina incluzii virale