intelegerea aspectelor fundamentale ale patogeniei si comportamentului clinico-evolutiv al LMNH este strans legata de cunoasterea principalelor caracteristici ale procesului de diferentiere limfocitara. Dirsele tipuri de LMNH pot fi privite ca reprezentand timentul malign al limfocitelor B sau T aflate in diferite stadii ale limfopoezei . Majoritatea acestor celule aflate in anumite stadii de diferentiere ca si timentul lor malign pot fi recunoscute morfologic. Limfocitele exprima insa receptori specifici pentru antigene, cunoscuti sub denumirea de markeri imunologi si care au structura glicoproteica, putand fi recunoscuti cu ajutorul unor anticorpi specifici. Acesti receptori sunt reprezentati de Ig membranare ale limfocitelor B si de receptorul T (TCR - "T-cell receptor") al limfocitelor T. Exprimarea lor la nilul membranei limfocitare, defineste starea de imuno-competenta atinsa de limfocitele S sau T.
Studiul diferentierii limfocitare a fost facilitat de aparitia si utilizarea anticorpilor monoclonali, precum si de dezvoltarea tehnicilor de biologie moleculara; aceste mijloace au permis definirea precisa a etapelor succesi ale diferentierii limfocitare si heterogenitarea lor functionala, aspecte pe care metodele morfologice si citochimice nu le puteau clarifica. Astfel, anticorpi monoclonali permit identificarea unui ansamblu de antigene exprimate de limfocitele B, dar nu si de limfocitele T sau inrs; aceste antigene reprezinta markeri de diferentiere ai limfocitelor B, respectiv ai limfocitelor T. in interiorul liniilor celulare B si T, anumite antigene nu sunt exprimate decat intr-un stadiu precoce de diferentiere si dispar ulterior, pe masura maturatiei limfocitare; acestea sunt markeri de maturatie. Exista apoi, markeri de activitate limfocitara,. prezenti in timpul desfasurarii ciclului celular din faza de proliferare. in prezent se afla la dispozitia cercetatorilor mijloace moderne de studiu al ADN-ului, care permit identificarea genelor codificatoare pentru lanturile de imunoglobulina (Ig) si pentru TCR si rearanjarea lor inca din cele mai precoce faze ale diferentierii limfocitelor B sau T. Rearanjarile genelor pentru Ig si pentru TCR sunt, ca atare, markeri de diferenpere; in masura in care fiecare clona este caracterizata printr-un rearanjament unic al acestor gene (V, D si J), ei pot fi etichetati si ca markeri de clonalitate, reprezentand expresia unui receptor unic specific pentru antigen .
Analizele imunofenotipice si imunogenotipice reprezinta, in momentul de fata, tehnici deosebit de importante (completand studiul morfologic) in analizarea bolilor limfoproliferati. Instigarea imunofenotipica este capabila sa distinga intre proliferarea policlonala si cea monoclonala a limfocitelor B sau T si ca atare intre limfoproliferarile benigne si cele maligne. Ea poate preciza linia celulara, subsetul si stadiul de diferentiere al limfocitelor maligne si ajuta detectarea bolii minime reziduale. Analiza imunogenotipica (demonstrarea rearanjarii genelor pentru Ig si TCR) este utila in determinarea liniei celulare si a clonalitatii proliferarii limfocitelor B sau T la nil molecular (in situatii care nu pot fi dodite prin studiile morfologice sau imunofenotipice) (5).

Markeri imuno-fenotipici limfocitari
Utilizarea anticorpilor monoclonali a stat la baza evidentierii celor mai importante antigene celulare, in contextul nomenclaturii CD ("cluster of differentiation") aplicate seriei limfocitare (elul nr. 3.1.1.). Determinarea fenotipului celular este urmarea identificarii moleculelor exprimate la suprafata sau in interiorul celulelor, cu ajutorul unor metode de imunomarcaj precum imunofluerescenta.

1. Caracteristicile imunofenotipice ale tesutului limfoid normal
(intalnite si in limfoproliferarile reacti, benigne) sunt prezente in urile 3.1.1., 3.1.2. si 3.1.3.
Se constata ca enzima TdT (terminal deexynucleotidyl transferaza) este exprimata pe membrana nucleara a celulelor limfoide imature, dar este absenta in stadiile mai avansate ale diferentierii limfocitare. Acest fapt este in legatura cu rolul important al TdT in rearanjarea genelor pentru Ig si pentru TCR in timpul stadiilor timpurii ale limfopoiezei.
a. Markerii CD-l9 si CD-22 sunt exprimati la suprafata celulara practic in toate stadiile diferentierii limfocitului B. Alti markeri de limfocit B (CD9, CD10, CD20, CD21, Y29/55, PCA-l, FMC-7) ca si variatele forme de expresie a Ig caracterizeaza limfocitele B pe parcursul diferentierii lor. Stadiul de limfocit pre-B (primul timent al diferentierii), de exemplu, este caracterizat prin exprimarea antigenului CD10 si exprimarea discreta a lantului greu u de Ig (Cyu). Fenotipul celulelor pre-B foarte tinere este clg+mlg-.
Compartimentul limfocitelor B cuprinde celulele circulante si din organele limfoide periferice, capabile de a se lega de antigen cu ajutorul unui receptor specific (mlgM=lgM membranara). Aceste celule circulante, aflate in faza G0 a ciclului celular, exprima de fapt si mlgD, dar au acelasi tip de lant usor k sau X, fenotipul lor fiind mlgM, mlgD k . Cel de-al treilea timent al diferentierii limfocitului B, cel al celulelor secretoare de Ig, cuprinde limfocitele aflate in curs de maturatie spre plasmocit. Progresiv mlg dispare, in timp ce clg se acumuleaza in citoplasma, ambele tipuri de Ig avand aceeasi monotipie a lanturilor usoare. Fenotipul cel mai obisnuit este clgG si clgA, ceea ce traduce existenta transformarii izotopice a lanturilor grele de Ig (u -> y, u. -a) .
b. Markerii CD-2 si CD-7 sunt exprimati pe suprafata celulei in toate stadiile diferentierii limfocitului T. in stadiile timpurii ale acestei diferentieri T apare si exprimarea citoplasmica a antigenului CD-3 (CyCD3), in timp ce limfocitele T mature exprima acest antigen la suprafata lor celulara in stransa asociere cu TCR (complexul TCR-CD3). Exprimarea altor markeri limfocitari T (precum CD1, CD4, CD5, CD8) este ilustrata in ura 3.3.2. Populatia de limfocite T cuprinde doua grupuri functional distincte: CD4+, CD8- (helper/inductoare) si CD4-, CD8+ (supresoare/citotoxice); raportul CD4/CD8 este variabil, cel mai adesea fiind de 1,5-3.
TCR se prezinta sub forma a doi heterodimeri (TCRaB si TCRy5) a caror exprimare nu este niciodata simultana. TCR78 este exprimat de o populatie redusa de limfocite T, celule care prezinta o activitate citotoxica de tip NK.
c. Dupa interactiunea cu antigenul, limfocitele devin acti, parasind faza G0 si trecand in faza G^ a ciclului celular. Limfocitele B activate exprima antigenul CD25 ca si antigenul CD-2 ("pan-T") si molecula CD23. .Limfocitul T va exprima si el molecula CD25 (care face parte din receptorul interieukinei 2); ulterior, exprimarea moleculelor de clasa a ll-a ale complexului major de histocompatibilitate (MHC-II) insoteste intrarea limfocitului in faza S (de sinteza ADN) a ciclului celular .
Studiile imunofenotipice au permis constatarea ca, din fiecare etapa a diferentierii morfologice iimfocitare se poate constitui o clona maligna, cu aparitia unui LM Aceasta reprezinta explicatia pentru heterogenitatea deosebita a acestui grup de limfoproliferari maligne si a reprezentat, totodata, un important punct de plecare pentru sistematizarile si clasificarile efectuate asupra LMNH in ultimii ani (alaturi de studiile genetice si de biologie moleculara).
Cand oprirea maturatiei se produce la un stadiu mai precoce al diferentierii (celule mai imature), limfoproliferarea va imbraca aspect asemanator LA limfoblastice. LMNH au insa, cel mai adesea, un fenotip imunologic mai matur. Se poate constata insa existenta, chiar in cadrul unui anumit tip de LMNH, a unor celule aflate in stadii diferite de diferentiere, ceea ce va face ca nu toate limfocitele din acea proliferare maligna sa prezinte markeri imunologici identici .
a. Proliferarea clonala a unui singur limfocit B malign va duce la constituirea LMNH cu origine celulara B (aproximativ 80% din cazuri), cu exprimarea mlg monotipice. Exprimarea doar a unui singur tip- de lant usor (k sau X.) poate ajuta afirmarea monoclonalitatii, citometria in flux aducand date valoroase in acest sens. Se considera ca exprimarea antigenului CD5 de catre limfocitele B, pierderea exprimarii antigenelor CD19, CD20 sau CD22 ar reprezenta o parte din aspectele imunofenotipice caracteristice LMNH de tip B (5).
b. Pentru afirmarea diagnosticului unui LMNH avand la baza proliferarea monoclonala a unui limfocit T, imunofenotipizarea aduce cateva elemete importante. Astfel, predominanta limfocitelor T (peste 80%) in cadrul unei limfoproliferari pledeaza pentru natura maligna a acesteia, mai ales atunci cand fenotipul celular este CD4+, CD8- sau CD4-, CD8+ (deci exista si o "restrictie" de manifestare a unor subseturi antigenice). Absenta unor antigene "pan-T de tipul CD2, CD3, CD5, CD7, in peste 50% din celulele proliferante, ca si absenta TCR, se considera a fi elemente importante pentru dodirea imunofenotipica a limfomului malign T (5).

Aspecte imunogenotipice Iimfocitare
Limfocitele B si T exprima pe suprafata membranei lor celulare receptori specifici pentru antigene, esentiali pentru functia de recunoastere antigenica si pentru generarea unui raspuns imun normal. Imunoglobulinele (formate din 2 lanturi grele identice, asociate cu 2 lanturi usoare identice, fie k, fie ) sunt exprimate exclusiv de limfocitele B, iar TCR este exprimat doar de limfocitul T. TCR se poate intalni (asa dupa cum s-a amintit mai sus) ca heterodimeri sub doua forme: ocB (majoritatea cazurilor) sau 78 (numai in 1% din cazuri si considerate a fi celule de tip NK).
Toate genele pentru receptorii antigenici au aceeasi structura generala si contin segmente variabile (V), constante (C) si de legatura (J); genele codificand lanturile grele de Ig si cele pentru lanturile 8 si 8 ale TCR contin si segmente D (dirsitate). Aceste segmente sunt separate in stadiile germinate. !n cursul diferentierii limfocitelor B si T, se produce un proces de recombinare a ADN, cu apropierea si juxtapunerea segmentelor V si C ale genelor pentru formarea Ig si TCR acti. Informatia genetica va aparea in citoplasma sub forma unui ARN-m functional. Aceasta rearanjare a genelor (ura nr. 3.1.4.) este mediata printr-un sistem de enzime numite recombinaze, mecanismul ei fiind identic, atat pentru genele pentru Ig cat si pentru genele pentru TCR. Procesul de rearanjare genica reprezinta un marker unic pentru fiecare celula, astfel incat evidentierea de rearanjari identice permite detectarea unei expresii de clonalitate si adesea afirmarea malignitatii. Perturbarile care apar in cadrul rearanjarii genelor pentru Ig sau pentru TCR pot fi corelate cu aparitia anumitor tipuri de limfoame cu celule B sau limfoame cu celule T.
Studiile imunogenotipice recurg in prezent la tehnici modeme, dintre care hibridizarea in contextul metodei "Southern blot" si multiplicarea fragmentelor de ADN cu ajutorul reactiei in lant a polimerazei (PCR - "polymerase chain reaction") reprezinta metodele cele mat utilizate si cu valoarea cea mai mare.
Markerul clonal din PCR difera de cel utilizat in Southern blot. in hibridizarea Southern blot, markerul clonal este reprezentat de conuratia segmentelor V-D-J rearanjate la locusul receptorului pentru antigen; in analiza PCR, markerul clonal este o secnta de nucleotide in interiorul genei rearanjate a receptorului pentru antigen, incluzand secntele cu inalta specificitate create la jonctiunea segmentelor de gene (5).
Se considera ca rezultatele analizelor imunogenotipice trebuie interpretate in corelatie cu datele obtinute din evaluarile morfologice si din instigatiile imunofenotipice.