Microbilologie

NAVIGARE RAPIDA: » Pagina principala » GHID MEDICAL » microbilologie

Diagnosticul de laborator al infectiei produse de gonococ - enterobacterii

 

ura 3: Cultura din col uterin. Stanga: mediul geloza-socolat: mai multe tipuri de colonii. Dreapta: mediul Thayer-Martin: cultura pura de gonococi. Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

caractere morfologice: frotiu din cultura care evidentiaza coci Gram negativi, in diplo, reniformi, nesporulati;

caractere biochimice: fermenteaza glucoza (ura 5), produce citocrom-oxidaza (testul oxidazei pozitiv) (ura 6);

caractere serologice: PCR (polymerase chain reaction) este o metoda de determinare a prezentei gonococilor in urina sau LCR.

2.4. Antibiograma

Pentru testarea sensibilitatii se foloseste metoda difuzimetrica. Se foloseste mediul HYL si suspensie microbiana. In terapie sunt indicate Penicilina, Tetraciclina, Kanamicina. Se pot utiliza de asemenea aminociclitolii (Spectinomicina) in doza unica.

ura 4: Gonococ - geloza sange. Dupa A Colour Atlas of Microbiology,

R.J. Olds 1975, 1986

ura 5: Fermentarea glucozei gonococ. Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic

Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

ura 6: Testul oxidazei - gonococ. Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Test pozitiv

Test negativ

e maxim DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR CU

ENTEROBACTERII

Enterobacteriile reprezinta o vasta familie din grupul bacteriilor Gram negative, cu o mare variabilitate genetica (morfologica, biochimica, antigenica, de patogenitate). Aceste microorganisme, dezvoltate in intestinul omului si animalelor in conditii ecologice complexe, cu un metabolism foarte activ, sunt supuse frecvent fenomenelor de transfer genetic (transformare, transductie, conjugare) cu posibilitatea aparitiei atat de populatii bacteriene rezistente sau multiplu rezistente la antibiotice, cat si de populatii bacteriene cu patogenitate crescuta. Prin aceste mecanisme de recombinare in vivo, plasticitatea enterobacteriilor este nesfarsita, cu implicatii pe terapeutic, epidemiologic si profilactic.

Enterobacteriile sunt bacterii de forma bacilara, majoritatea mobile (imobile: Shigella, Klebsiella), majoritatea necapsulate (exceptie Klebsiella), aerob sau facultativ anaerobe, nesporulate.

Unele dintre ele sunt intotdeauna patogene (Shigella si Salmonella), altele sunt comensale, intrand in componenta florei intestinale normale, dar la care se evidentiaza un potential de patogenitate (E. coli, Proteus, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter etc.). Acestea din urma sunt incriminate mai ales in etiologia infectiilor tractului digestiv, urinar, respirator si in infectiile intraspitalicesti. Patogenitatea intrinseca a enterobacteriilor conditionat-patogene (determinata de un bogat echipament enzimatic, de prezenta antigenelor de invelis, a endotoxinei, enterotoxinei, prezenta plasmidelor etc.) se exacerbeaza atunci cand statusul biologic al macroorganismului agresionat este modificat in sensul receptivitatii, prin deficite imune, boli medico-chirurgicale de fond, tratamente imunosupresive etc.

Majoritatea enterobacteriozelor predominent digestive precum si a celor extradigestive se pot complica cu bacteriemii, septicemii, soc endotoxinic, complicatii severe greu de stapanit terapeutic.

Clasificarea enterobacteriilor, care a suferit o serie de modificari in decursul anilor, a avut la baza mai ales proprietatile biochimice si antigenice. In acest sens, se admite in momentul de fata existenta urmatoarelor triburi si genuri (tabelul 1):

Tabelul 1: Incadrarea enterobacteriilor

La majoritatea enterobacteriozelor, care evolueaza ca boli infectioase acute, investigatiile de laborator se axeaza pe diagnosticul bacteriologic, in timp ce in febrele tifoide si febrele paratifoide, boli sistemice cu evolutie prelungita, se practica in plus si diagnosticul imunologic sau serodiagnosticul.

1. RECOLTAREA SI PRELUCRAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

Produsele patologice se vor preleva cat mai aproape de debutul bolii si in functie de diagnosticul clinic, inainte ca pacientului sa i se fi administrat antibiotice. Recoltarea se face corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectand toate normele de asepsie si antisepsie.

Se recolteaza:

materii fecale (E. coli, Shigella, Salmonella) din scaunul emis spontan sau direct din rect (sonda Nelaton); in cazul purtatorilor de Salmonella si Shigella (elimina intermitent germenii) se recolteaza 3 coproculturi, 3 zile succesiv, dupa administrarea unui purgativ salin. Prelevatele se introduc in mediul de conservare si transport Carry-Blair;

sange (Salmonella) recoltat prin punctie venoasa: pentru hemocultura si pentru diagnostic serologic;

urina (Proteus, E. coli, Klebsiella) recoltata prin metoda jetului mijlociu, dupa toaleta riguroasa a organelor genitale externe;

sputa (Klebsiella pneumoniae);

bila (Salmonella, Klebsiella) prin tubaj duodenal cu sonda Einhorn;

puroi (Proteus, Klebsiella) recoltat in functie de tipul colectiei purulente: cu ansa, tamponul, pipeta Pasteur sau punctionare si aspirare cu seringa.

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (MICROBIOLOGIC)

2.1. Examenul direct

Se efectueaza frotiuri direct din produsele patologice, colorate Gram, cu mare importanta pentru produsele patologice normal sterile. Se evidentiaza bacili Gram negativi, necapsulati (exceptie Klebsiella - ura 1), mobili pe preparatele native prin prezenta cililor - ura 2)(exceptie Klebsiella, Shigella), monomorfi, rareori polimorfi (forme cocoide, filamentoase in cazul genului Proteus).

ura 1: Bacili Gram negativi, capsulati, in diplo - Klebsiella. Dupa Atlas de Bacteriologie: Examens directs par colorations usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F. Acar. 1993

2.2. Izolarea

Se realizeaza prin insamantarea pe medii de cultura si inocularea produselor patologice la animalele sensibile de laborator (exemplu. izolarea Klebsiellei pe soarecii albi).

Categorii de medii de cultura utilizate:

ura 2: Bacterii intestinale ciliate (http //www. Lab Index, Photo Atlas)

mediu de conservare si transport: mediul semisolid Carry-Blair (thioglicolat de sodiu, clorura de calciu, fosfat disodic) ce permite viabilitatea germenilor patogeni aproximativ 4-6 zile;

medii de imbogatire (medii lichide care favorizeaza inmultirea anumitor bacterii patogene inhiband selectiv dezvoltarea florei de asociatie): bulion tetrationat Muller-Kauffmann si bulion selenit acid de sodiu pentru Salmonella;

medii simple: bulion, geloza simpla;

medii complexe: geloza sange;

medii selective (geloza, bila sau saruri biliare, lactoza, indicator) generale (Istrate-Meitert, Leifson, Mac-Conkey) si speciale (Levine pentru E. coli; Wilson-Blair pentru Salmonella typhi);

medii diferentiale (diferentiaza diferite tipuri de bacterii): mediul Drigalski, geloza lactozata cu albastru de brom timol care diferentiaza bacteriile lactozo-pozitive de cele lactozo-negative.

2.3. Identificarea

a. Caractere de cultura

Pe medii simple solide, dupa incubare 24 de ore la 37 C, enterobacteriile formeaza, de regula, colonii mari, rotunde, convexe (de tip S), opace, semitransparente sau transparente; cele capsulate determina colonii mucoase, filante,  in picatura de miere (Klebsiella) (ura 3); la genul Proteus apare fenomenul de invazie si catarare (ura 4).

Pe medii simple lichide: tulbura intens mediile, cu formarea unei pelicule fine la suprafata (genul Proteus) sau a unei membrane groase (Klebsiella).

Pe medii simple lichide: tulbura intens mediile, cu formarea unei pelicule fine la suprafata (genul Proteus) sau a unei membrane groase (Klebsiella).

Pe mediile selective coloniile au urmatoarele aspecte:

pe mediul Leifson: prin fermentarea lactozei de catre bacteriile lactozo-pozitive (E. coli, Klebsiella, unele tulpini de Citrobacter) se realizeaza un mediu acid care determina virajul indicatorului, coloniile aparand de culoare rosie; bacteriile lactozo-negative (Proteus, Salmonella, Shigella) sunt necolorate, cu centru negru pentru Salmonella si Proteus;

	ura 3: Colonii mucoase, filante, in picatura de miere - Klebsiella pneumoniae. Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

pe mediul Istrate-Meitert: colonii de tip S, galbene la germenii lactozo-pozitivi (E. coli, Klebsiella) sau, la germenii lactozo-negativi, in culoarea mediului (Proteus, Salmonella, Shigella), opace (E. coli, Klebsiella, Proteus), semitransparente si albastrui (Salmonalla), transparente si verzui (Shigella);

pe mediul Mac Conkey coloniile lactozo-pozitive sunt rosii, iar cele lactozo-negative necolorate;

pe mediul Levine: coloniile lactozo-pozitive sunt negre cu luciu metalic, cele lactozo-negative sunt necolorate;

pe mediul Wilson-Blair coloniile de Salmonalla sunt negre cu luciu metalic; Salmonella typhi produce si colonii verzi, mici, fara halou. Celelalte bacterii din aceasta familie se dezvolta greu pe acest mediu, dand colonii brune;

pe mediile diferentiale (geloza lactozata cu albastru de brom timol), coloniile lactozo-pozitive sunt galbene, cele lactozo-negative sunt verzui.

b. Caractere morfologice

Pentru testarea mobilitatii se efectueaza fie un preparat proaspat intre lama si lamela, fie se urmareste mobilitatea in urma insamantarii pe geloza semisolida (metoda tubului in U) sau se utilizeaza mediul politrop MIU (urile 5, 6, 10 si 11).

Frotiul colorat Gram evidentiaza bacili Gram negativi, nesporulati, necapsulati (exceptie Klebsiella) (ura 7).

ura 5: Mediul MIU - testarea mobilitatii.

Dupa: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975,1986

ura 6: Mediul MIU - testarea mobilitatii. Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

ura 7: Bacili Gram negativi - frotiu cultura. Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

c. Caractere metabolice (biochimice)

Dintre testele biochimice care permit incadrarea in familie, trebuie mentionate:

degradarea oxidativa si fermentativa a glucozei (ura 8);

reducerea nitratilor in nitriti

lipsa citocromoxidazei

In continuare, diferentierea triburilor si a unor genuri si specii se realizeaza prin alte reactii biochimice cum ar fi:

testul indol (ura 9);

reactia la rosu de metil

reactia Voges-Proskauer

utilizarea citratului ca unica sursa de carbon si energie (ura 12);

producerea de hidrogen sulfurat (urile 10 si 11);

producerea ureazei

producerea lizindecarboxilazei, fenilalanindezaminazei etc.

ura 8: Degradarea oxidativa si fermentativa a glucozei Dupa: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975,1986

Lipsa fermentarii glucozei

Fermentarea glucozei, cu producere de gaz colectat in tubusor Durham

Producerea de indol

Triptofanul din mediul de cultura este transformat (prin dezaminare) in acid indol-carbonic si apoi in indol (ura 9).

Tehnica: cultura de cercetat este trecuta in apa peptonata cu incubare 24 de ore la 37 C; aparitia indolului se evidentiaza cu ajutorul reactivului Ehrlich, care se adauga peste cultura. Aparitia unui inel rosu-rubiniu la suprafata mediului indica prezenta indolului.

Se mai poate utiliza pentru demonstrarea prezentei indolului si mediul MIU. Reactia pozitiva este apreciata pe baza colorarii in rosu a hartiei indicatoare atasate la dop (imbibata in prealabil in reactiv Ehrlich).

Exemple de bacterii indol pozitive: E. coli, biotipuri de Proteus, biotipuri de Shigella.

In tabelul 2 sunt prezentate principalele caractere de diferentiere ale genurilor mai importante.

Tabelul 2: Teste biochimice diferentiale ale principalelor genuri

O categorie importanta de medii sunt cele politrope (testeaza mai multe caractere biochimice pe acelasi tub):

TSI (trei zaharuri cu fier) (urile 10 si 11);

MIU (mobilitate, producerea de indol, ureaza).

ura 9: Producerea de indol. Dupa: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975,1986

Mediu control

Reactie negativa

Reactie pozitiva

ura 10: Variante ale mediului TSI. Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Klebsiella E. coli

Mediu neinsmantat

Citrobacter

Salmonalla typhi

Shigella flexneri

Specii Proteus, Salmonella

Proteus-specii Salmonalla typhi Shigella-specii

ura 11: Variante ale mediului TSI. Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Urmarind identificarea bacteriilor pe baza proprietatilor metabolice si incadrarea lor in gen, specie si biotip, se mai folosesc si alte medii de diagnostic biochimic:

pentru urmarirea spectrului fermentativ al zaharurilor se foloseste apa peptonata cu adaus de diverse zaharuri si un indicator de culoare (rosu fenol sau albastru de brom timol) (ura 12);

mediul Clark-Lubs pentru evidentierea reactiei la rosu-metil si pentru urmarirea reactiei Voges-Proskauer;

mediul cu citrat - Simmons si mediul malonat pentru evidentierea surselor de carbon si azot folosite de enterobacterii (ura 13);

ura 12: Spectrul fermentativ al zaharurilor (http //www. Lab Index, Photo Atlas)

ura 13: Spectrul fermentativ al zaharurilor (http //www. Lab Index, Photo Atlas)

ura 14: Decarboxilarea fenilalaninei. Dupa: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975,1986

pentru demonstrarea prezentei unor enzime cu actiune asupra unor aminoacizi, cum ar fi fenilalanindezaminaza (ura 14), sau lizindecarboxilaza, se foloseste mediul gelozat care include pe rand aminoacidul respectiv

d. Caractere antigenice (identificarea serologica)

Proprietatile antigenice servesc pentru caracterizarea genurilor si, in special, a speciilor din cadrul acestora si serotipurilor circulante intr-o anumita perioada de timp intr-o colectivitate, tinand cont de existanta antigenelor somatice (O), de invelis (K si Vi) si flagelare (H).

Identificarea serologica a reprezentantilor familiei Enterobacteriaceae se realizeaza prin reactii antigen-anticorp, in care elementul necunoscut este antigenul (antigenele bacteriei izolate) si elementul cunoscut este reprezentat de anticorpii specifici dintr-un ser imun standard (obtinut prin inocularea unui animal de laborator).

In acest scop se folosesc doua reactii: reactia de aglutinare pe lama si in tuburi (pentru Salmonella, Shigella, E. coli enteropatogen) si reactia de umflare a capsulei (pentru Klebsiella).

Reactia de aglutinare pe lama se face amestecand o picatura din serul standard cu o suspensie de germeni provenind din cultura pura a germenului de pe mediu neselectiv. Se urmareste aparitia grunjilor de aglutinare care apar numai in cazul corespondentei imune dintre antigen si anticorp, identificand cu certitudine bacteria izolata. In cazul in care nu exista corespondenta imuna dintre cei doi reactanti imuni lichidul ramane lactescent (ura 15).

ura 15: Reactia de aglutinare pe lama. Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Poate exista si o corelatie intre diferitele serotipuri de enterobacterii si patogenitate. Un exemplu este intalnit la E. coli. Astfel, in infectiile urinare s-au izolat serotipurile O₄, O₇, O₇₅, in diareea maligna a noului-nascut serotipurile O₅₅B₅, O₁₂₆B₆. Dintre tulpinile enteropatogene (EPEC) s-a evidentiat O₁₅₇H₇ iar dintre tulpinile enterohemoragice (EHEC) s-a identificat O₂₆H₁₁, O₁₁₉H₂.

Pentru identificarea tulpinilor patogene infantile de E. coli se practica si tehnica imunofluorescentei directe. Se efectueaza frotiuri din materiile fecale, care se acopera cu seruri fluorescente anti E. coli polivalent si monovalente. Dupa incubarea necasara se citesc in lumina ultravioleta. In cazul corespondentei imune vor apare aglutinate fluorescente.

e. Caractere de patogenitate

Aceasta identificare se practica in cazul reprezentantilor genului Klebsiella si Shigella prin studiul patogenitatii in vivo, in urma inocularii cu prelevat din cultura suspecta la soarecele alb in primul caz si prin inoculare intraconjunctivala la iepure sau cobai, in al doilea caz (testul Serenny).

Soarecele alb inoculat subcutanat cu un filtrat de cultura de Klebsiella moare cu septicemie in 18-24 ore. Se izoleaza Klebsiella din sangele din cordul animalului prin tehnica hemoculturii.

Testul Serenny se recomanda pentru diagnosticul complementar al tulpinilor de Shigella izolate recent. Tehnica consta in introducerea unei anse de cultura (obtinuta pe mediu simplu) sub pleoapa unui iepure sau cobai. Dupa 12 ore in cazul in care germenii sunt din genul Shigella apare o congestie conjunctivala, o secretie mucopurulenta abundenta urmata de opacifierea corneei si se instaleaza keratoconjunctivita.

f. Sensibilitatea la bacteriofagii litici (lizotipia)

Lizotiparea tulpinilor apartinand aceleiasi specii se efectueaza pentru a elucida problemele legate de stabilirea sursei de infectie, a cailor de transmitere si filiatiei cazurilor in enterobacteriozele epidemice (Salmonella).

ura 16: Lizotipia. Dupa: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

2.4. Antibiograma

Datorita comportamentului variat fata de chimioterapice a enterobacteriilor, se impune efectuarea obligatorie a antibiogramei.

3. DIAGNOSTIC SEROLOGIC

In aceasta etapa se evidentiaza anticorpii aparuti in serul bolnavilor, ca urmare a infectiei sau eventual a vaccinarii.

Are la baza reactii antigen-anticorp de aglutinare in care elementul necunoscut este reprezentat de anticorpii din serul de bolbav, iar elementul cunoscut de antigenele standard (reactia Widal in salmonelozele majore).

Evidentierea anticorpilor si mai ales cresterea titrului la dublu intre doua recoltari de ser are valoare de diagnostic de boala, dar poate depista si purtatorii de germeni, ca si trecerea prin infectii inaparente.

a importanta.