Diagnosticul de laborator al infectiilor cu hemofili

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR CU HEMOFILI

Infectiile umane produse de reprezentantii genului Haemophilus sunt variate ca manifestare si gravitate: meningita, epiglotita, pneumonia, bronsita acuta, acutizarea bronsitelor cronice si bronsiectaziilor, pleuropneumonia, sinuzita, otita medie acuta si cronica, mastoidita, conjunctivita, endocardita, pericardita, osteomielita, artrita, peritonita, hepatita, colecistita, uretrita, prostatita, orhiepididimita, vaginita, salpingita, endometrita etc.

Speciile de hemofili izolate de la om la om sunt:

H.influenzae;

H.aegyptus (conjunctivitidis);

H.haemolyticus;

H.parahaemolyticus;

H.dycrey;

H.vaginalis.

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

Se recolteaza: sputa, exudat faringian, exudat nazal, spalatura bronsica, LCR, secretie conjunctivala, otica, uretrala, vaginala, sange, lichid pleural, pericardic, articular, raclaje cutanate sau mucoase, materii fecale, fragmente de tesuturi sau organe - in caz de interventii chirurgicale sau deces.

Tampoanele de recoltare trebuie sa fie imbibate in bulion inainte ca proba sa fie recoltata si transportate rapid la laborator. Probele vor fi pastrate pana la insamantare la temperatura laboratorului, nu in frigider, iar durata sa nu depaseasca 2 ore, intrucat viabilitatea hemofililor este mult mai redusa prin uscare si racire.

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

2.1. Examenul direct

Se foloseste pentru: sputa, exudate, aspirate, secretii si sedimentul obtinut prin centrifugarea LCR si a exudatelor lichide, numai pentru a determina prezenta bacililor Gram negativ.

In efectuarea coloratiei Gram, trebuie avuta mare grija in efectuarea decolorarii, deoarece formele cocobacilare de H.influenzae pot fi confundate in morfologie cu pneumococii. Daca ei se coloreaza bipolar, iar restul organismului sa fie colorat pal, se pot confunda cu Gram pozitivii.

Se poate efectua un test direct de umflare a capsulei cu ser de tip H.influenzae.

Imunofluorescenta cu ser capsular conjugat cu fluoresceina este un alt mijloc excelent de identificare a tulpinilor capsulate.

2.2. Izolarea

Se folosesc medii in care celulele sanguine au fost lizate printr-o incalzire usoara (agar-chocolat si Lewinthal) sau prin digestie peptica (agar Fildes). In astfel de medii hemina si NAD sunt prezente in aprox. 500 micrograme si respectiv 150 micrograme/ml. Incubarea se face la 37⁰C in 5-l0 % CO₂, timp de 18-72 de ore.

2.3. Identificarea

a. Caractere de cultura

H.influenzae da colonii mici, gri sau semiopace, netede si plat convexe, cu margini regulate. Tulpinile capsulate tind sa se dezvolte confluent, in contrast cu coloniile tulpinilor necapsulate, care raman separate. Coloniile de H.parainfluenzae pot avea un diametru pana la 3 mm dupa incubare de 24 de ore si apar netede sau rugoase si crenelate, gri-lucioase si semiopace. Activitatea hemolitica a hemofililior hemolitici poate fi evidentiata pe agar Fildas sau Lewinthal, cu 5% sange bovin sau de cal si agar-sange de la aceleasi specii (ura 1).

In jurul coloniilor de Staphilococcus aureus dezvolta colonii mai mari (fenomen de satelitism), datorita suplimentului de factor V furnizat de stafilococi (urile 2 si 3).

b. Caractere morfologice

Frotiul colorat Gram evidentiaza cocobacili Gram negativi polimorfi. Tulpinile virulente prezinta uneori capsula (ura 4).

c. Caractere metabolice

Reactiile fermentative sunt foarte valoroase pentru diferentierea speciilor de hemofili. Carbohidratii cu valoare de identificare sunt: glucoza, zaharoza, lactoza, xiloza, manitolul si riboza.

Alte teste folosite: testul indolului, testul ureazei, activitatea decarboxilazelor si a betagalactozidazei. Suplimentarea mediului cu factorii X, V sau X+V diferentiaza speciile de Haemophilus: H.influenzae si H.aegyptus necesita factor X+V; H.ducrey necesita numai factor X.

ura 1: H. influenzae - cultura pe agar-cholat din lichid cefalorahidian. Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

ura 2: H. influenzae - satelitism in prezenta stafilococilor pe geloza sange. Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

d. Caractere antigenice

Se foloseste identificarea serologica pentru tulpinile capsulate de H.influenzae care pot fi diferentiate in 6 serotipuri bazate pe 6 polizaharizi capsulati distincti: a, b, c, d, e, f. Se folosesc: reactia de umflare a capsulei, dubla difuzie in gel de agar, imunofluorescenta, contraimunoelectroforeza, latexaglutinarea, aglutnarea pe lama si coaglutinarea.

ura 4: H. influenzae - frotiu colorat Gram din cultura. Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979